Développement de nouveaux di-affibodies pour des applications en bioimagerie et immunothérapie
Le développement de thérapies ciblées innovantes est un enjeu majeur en oncologie. Les affibodies (AfBs), en raison de leurs propriétés avantageuses (taille, stabilité, coût, affinités, tolérance), représentent une alternative prometteuse aux anticorps monoclonaux. Notre objectif est le développemen...
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| Andre forfattere: | , , , |
| Format: | Thèse numérique |
| Sprog: | Français |
| Udgivet: |
2025.
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| Fag: | |
| Online adgang: | Accès Université d'Orléans et IFPM |
| Kommentar: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Séverine Morisset-Lopez (Président du jury) ; Yung-Sing Wong, Guillaume Bort (Rapporteur(s)) Thèse sous embargo actif |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Development of novel di-affibodies for applications in bioimaging and immunotherapy |
| Summary: | Le développement de thérapies ciblées innovantes est un enjeu majeur en oncologie. Les affibodies (AfBs), en raison de leurs propriétés avantageuses (taille, stabilité, coût, affinités, tolérance), représentent une alternative prometteuse aux anticorps monoclonaux. Notre objectif est le développement de nouvelles constructions de di-affibodies pour des applications en bioimagerie et immunothérapie. Dans cette optique, nous rapportons la conception de nouveaux linkers fluorescents polyvalents (L1-L3, L1N) adaptés à l'assemblage covalent de motifs de reconnaissance spécifiques pour cibler des molécules biologiquement pertinentes. La plateforme d'ancrage fluorescente, un dérivé du dimethoxyquinacridinium, émet en rouge et constitue un élément clé pour la synthèse de conjugués et leurs analyses ultérieures. La synthèse de ces précurseurs a été optimisée en amont à travers des études cinétiques. De plus, les mesures spectrophotométriques de leurs interactions avec des biomolécules représentatives (SAB, ARN, ADN) ont démontré une faible affinité avec la protéine SAB (~mM), comparée aux affinités avec les acides nucléiques (ARN, ADN), de l'ordre du M. La présence de groupements amines permet une fonctionnalisation simple avec des linkers PEG bifonctionnels (NHS, MI) de longueur variable (n = 2 ou 12) pour une bioconjugaison ultérieure. Les affibodies ont été produits par synthèse sur support solide (SPPS) avec un unique résidu de cystéine incorporé en position N-terminale (N-AfB; E-AfB) ou C-terminal (C-AfB). L'assemblage des différents constituants moléculaires (fluorophore, linker, affibody) a été réalisé à partir de réactions de bioconjugaison simple et rapide (NHS ester/amine, thiol/maléimide). Dans un premier temps, et pour démontrer le concept, nous avons conjugué nos linkers avec des affibodies ciblant HER2 (N-AfB ou C-AfB). Sept conjugués (mono- et di- AfBs) ont été obtenus et caractérisés. Leur liaison spécifique aux cellules SKOV3 surexprimant HER2 a été démontrée par cytométrie en flux, avec des affinités nanomolaires, et visualisée par microscopie confocale. L'internalisation des constructions AfB dans les cellules SKOV3 a été étudiée grâce à la mesure de leur fluorescence en cytométrie après traitement à la trypsine. Dans une seconde partie, la versatilité des plateformes d'ancrage a été démontrée par la synthèse de deux di-AfBs bispécifiques ciblant simultanément HER2 (N-AfB ; C-AfB) et EGFR (E-AfB). Les tests sur lignées cellulaires (MDA-MB-231, SKBR3, SKOV3) ont montré que le conjugué bispécifique se liait aux deux cibles, lorsqu'elles étaient surexprimées, avec une affinité nanomolaire, contrairement aux agents monovalents. En conclusion, la conception de linkers versatiles et des assemblages directionnels polyvalents ouvre des perspectives intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses et/ou d'outils de diagnostic pour le suivi au niveau cellulaire. The development of innovative targeted therapies is a major challenge in oncology. Affibodies (AfBs) represent a promising alternative to monoclonal antibodies due to their advantageous properties (size, stability, cost, affinity, and tolerance). Our objective is the development of new di-affibody constructs for applications in bioimaging and immunotherapy. In this context, we report the design of new versatile fluorescent linkers (L1-L3, L1N) adapted for the covalent assembly of specific recognition motifs to target biologically relevant molecules. The fluorescent anchoring platform, a derivative of dimethoxyquinacridinium, emits in the red spectrum and constitutes a key component for the synthesis of conjugates and their subsequent analyses. The synthesis of these precursors was optimized beforehand through kinetic studies. In addition, spectrophotometric measurements of their interactions with representative biomolecules (SAB, RNA, DNA) showed weak affinity for the SAB protein (~mM), compared to stronger affinities for nucleic acids (RNA, DNA) in the micromolar range. The presence of amine groups allows for straightforward functionalization with bifunctional PEG linkers (NHS, MI) of varying lengths (n = 2 or 12) for further bioconjugation. Affibodies were produced via solid-phase peptide synthesis (SPPS), with a single cysteine residue incorporated either at the N-terminal position (N-AfB, E-AfB) or at the C-terminal (C-AfB). The assembly of the different molecular components (fluorophore, linkers, affibody) was carried out using simple and rapid bioconjugation reactions (NHS ester/amine, thiol/maleimide). As a first proof of concept, we conjugated our linkers with affibodies targeting HER2 (N-AfB or C-AfB). Seven conjugates (mono- and di-AfBs) were obtained and characterized. Their specific binding to SKOV3 cells overexpressing HER2 was demonstrated by flow cytometry (nanomolar affinities) and visualized by confocal microscopy. The internalization of AfB constructs into SKOV3 cells was studied by measuring fluorescence also via flow cytometry after trypsin treatment. In a second part, the versatility of the anchoring platforms was further demonstrated by synthesizing two bispecific di-AfBs simultaneously targeting HER2 (N-AfB, C-AfB) and EGFR (E-AfB). Tests on cell lines (MDA-MB-231, SKBR3, SKOV3) showed that the bispecific conjugate bound to both targets (when overexpressed) with nanomolar affinity, unlike monovalent agents. In conclusion, the design of versatile linkers and modular directional assemblies opens up promising perspectives for the development of new anticancer therapies and/or diagnostic tools for cell-level monitoring. |
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| Emne beskrivelse: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Séverine Morisset-Lopez (Président du jury) ; Yung-Sing Wong, Guillaume Bort (Rapporteur(s)) Thèse sous embargo actif |
| Format: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Adgang: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 01 janvier 2027 |