Nouvelles méthodologies pour la chimio-ingénierie des protéines : bioconjugaison de peptides riches en ponts disulfures, auxiliaire solubilisant et identification de ligands en configuration miroir
Les D-protéines synthétiques, constituées uniquement d'acides aminés de configuration D et de la glycine achirale, représentent la version miroir des protéines naturelles. Leur grande résistance à la protéolyse ainsi que leur faible immunogénicité in vivo en font des candidats prometteurs pour...
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| 1. Verfasser: | |
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| Weitere Verfasser: | , , , , , |
| Format: | Thèse numérique |
| Sprache: | Français Anglais |
| Veröffentlicht: |
2026.
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | Accès Université d'Orléans et IFPM |
| Anmerkung: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Franck Suzenet (Président du jury) ; Gilles Guichard, Séverine Morisset-Lopez, Vangelis Agouridas (Membre(s) du jury) ; Gilles Guichard, Sonia Cantel (Rapporteur(s)) Thèse sous embargo actif |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | New methodologies for protein chemo-engineering :, bioconjugation of disulfide-rich peptides, solubilizing tag, and identification of ligands in mirror-image configuration |
| Zusammenfassung: | Les D-protéines synthétiques, constituées uniquement d'acides aminés de configuration D et de la glycine achirale, représentent la version miroir des protéines naturelles. Leur grande résistance à la protéolyse ainsi que leur faible immunogénicité in vivo en font des candidats prometteurs pour le développement d'outils thérapeutiques innovants. En dépit de leur potentiel, elles ne sont que peu utilisées du fait du manque de procédés de découverte efficaces et généraux. Dans ce projet, nous explorons une nouvelle approche multidisciplinaire permettant la conception de D-VHHs, pouvant se lier à deux cibles biologiques : le récepteur 5-HT et la protéine LINGO-1. Cette stratégie que nous avons nommée Mirror Image Immunization Strategy, MIIS , repose sur l'immunisation de camélidés avec la version miroir d'un peptide issu d'une protéine cible naturelle. Ce D-peptide qui n'est pas immunogène en soi, le devient lorsqu'il est administré sous forme d'un conjugué hybride où le D-peptide est lié de façon covalente à une protéine L fortement immunogène. Dans ce contexte, nous avons mis au point une stratégie de bioconjugaison de peptides riches en ponts disulfures, qui repose sur l'introduction d'un espaceur rigide afin d'éloigner le thiol exogène nécessaire à la conjugaison thiol-maléimide et ainsi préserver la connectivité native des ponts disulfure de l'antigène. En parallèle, les L-VHHs découverts par MIIS contre un D-peptide issu du 5-HT R ont été produits de façon recombinante et leur interaction stéréospécifique a été confirmée par ITC et FIDA. Au cours de la synthèse chimique totale d'un des VHH, nous avons été confrontés à un obstacle majeur : la faible solubilité de certains segments peptidiques nécessaires à son assemblage par ligation chimique native (NCL). Pour pallier cette limitation, nous avons développé un nouvel auxiliaire solubilisant temporaire, composé de trois lysines pré-installées sur un dérivé du groupement Hmb (2-hydroxy-4-méthoxybenzyle), lequel est stable dans les conditions de NCL et peut être ensuite coupé dans des conditions douces. L'efficacité de l'auxiliaire solubilisant a été validée par la synthèse par NCL de la protéine SUMO-2, dont la partie C-terminale est connue pour sa propension à l'agrégation. En parallèle, afin de valider le nouveau processus de découverte, nous avons exploité les séquences des boucles hypervariables 3 (CDR3) des VHHs pour la conception de D-ligands cycliques miniaturisés. Synthetic D-proteins, entirely composed of D-amino acids and achiral glycine, represent the mirror image of natural proteins. In light of their enhanced resistance towards proteolysis and their low immunogenicity in vivo, D-proteins hold a tremendous potential for the development of novel therapeutic agents. The key limitation hindering their development is caused by the lack of efficient and generalizable discovery processes. In this project, we explore a new multidisciplinary approach for the identification of D-VHH proteins able to recognize the 5-HT receptor and the LINGO-1 protein. This strategy, which we have called Mirror Image Immunization Strategy, MIIS , is based on the in vivo immunization of camelids with the chirally inverted version of a target peptide from a native target. The D-peptide, which is not immunogenic per se, becomes so when administered as a covalent hybrid conjugate displaying copies of the D-peptide on the surface of an immunogenic L-protein carrier. In this context, we have developed a general strategy for the bioconjugation of disulfide rich peptides that relies on the introduction of a rigid spacer to distance the additional thiol, needed for the thiol-maleimide conjugation, thus preserving the peptide's native disulfide connectivity. Alongside this work, the L-VHHs identified by MIIS against D-peptides from the 5-HT R were recombinantly expressed, and their stereospecific interaction was evaluated by ITC and FIDA. During the total chemical synthesis of a VHH, we were confronted with a significant challenge: the poor solubility of certain peptide segments required for assembly through native chemical ligation (NCL). To overcome this limitation, we have developed a novel temporary solubility tag displaying three lysines, pre-installed on a linker derived from the Hmb functional group (2-hydroxy-4-methoxybenzyl), that is stable under NCL conditions but can subsequently be removed under mild conditions. To demonstrate the utility of this approach, we have validated the efficiency of the solubility tag via the chemical synthesis of the SUMO-2 protein, whose C-terminal segment is known for its propensity to aggregate. In parallel, in order to validate the new discovery process, we have exploited the sequences of the hypervariable loop 3 (CDR3) of the VHHs for designing miniaturized D-cyclic ligands. |
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| Beschreibung: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Franck Suzenet (Président du jury) ; Gilles Guichard, Séverine Morisset-Lopez, Vangelis Agouridas (Membre(s) du jury) ; Gilles Guichard, Sonia Cantel (Rapporteur(s)) Thèse sous embargo actif |
| Format: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Zugangseinschränkungen: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 16 décembre 2028 |