Évaluation de l'ARN messager synthétique délivré par des nanoparticules lipidiques : impact des lipides helper et des éléments UTR/poly(A) sur l'efficacité d'expression
L'ARN messager (ARNm) est apparu comme une plateforme prometteuse pour le développement de nouveaux médicaments. L'efficacité de la technologie ARNm dépend à la fois de la délivrance efficiente et de la traduction efficace des molécules d'ARNm. Malgré le succès remarquable des vaccins...
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| Další autoři: | , , , , , |
| Médium: | Thèse numérique |
| Jazyk: | Français |
| Vydáno: |
2025.
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| Témata: | |
| On-line přístup: | Accès au texte intégral https://theses.univ-orleans.fr/public/2025ORLE1078_va.pdf https://theses.fr/2025ORLE1078/abes https://theses.hal.science/tel-05632885 |
| Poznámka: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Marc Boudvillain (Président du jury) ; Clément Chapat, Josef Hamacek (Membre(s) du jury) ; Maria Duca, Emmanuelle Schmitt (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Evaluation of synthetic messenger RNA delivered by lipid nanoparticles :, impact of helper lipids and UTR/poly(A) elements on expression efficacy |
| Shrnutí: | L'ARN messager (ARNm) est apparu comme une plateforme prometteuse pour le développement de nouveaux médicaments. L'efficacité de la technologie ARNm dépend à la fois de la délivrance efficiente et de la traduction efficace des molécules d'ARNm. Malgré le succès remarquable des vaccins à ARNm contre le SARS-CoV-2, des progrès restent nécessaires pour améliorer les systèmes de délivrance et la conception de la séquence d'ARNm, en vue d'optimiser l'efficacité des vaccins et thérapies à ARNm. La première partie de cette thèse a porté sur les nanoparticules lipidiques (LNPs) comme vecteurs de délivrance pour l'ARNm synthétique. Trois compositions de LNP, toutes contenant le lipide ionisable D-Lin-MC3 mais différant par la nature du lipide auxiliaire (DSPC/cholestérol, DOPE/cholestérol et DOPE/b-Sitostérol), ont été comparées in cellulo et in vivo afin d'identifier les lipides auxiliaires les plus efficaces pour la délivrance de l'ARNm. Nos résultats montrent que le choix du lipide auxiliaire influence l'efficacité de la transfection in vivo, et que les formulations contenant du DOPE montrant des performances supérieures. La seconde partie de cette thèse a porté sur l'optimisation des éléments de séquence de l'ARNm. Dans l'objectif d'améliorer la traduction de l'ARNm synthétique, nous avons évalué différentes séquences non traduites (UTRs) et queues poly(A), en utilisant la conception de séquence du vaccin COVID-19 de Pfizer-BioNTech comme référence. Nous avons d'abord évalué six régions 5' UTR (dépendantes ou indépendantes de la coiffe), neuf combinaisons 5' UTR-3' UTR, ainsi qu'une nouvelle queue hétérologue A/G, en modèles cellulaires et in vivo avec la luciférase comme gène rapporteur. Afin de mieux comprendre le mécanisme de traduction des UTRs sélectionnées, nous avons corrélé l'expression de l'ARNm avec la charge ribosomale, la demi-vie de l'ARNm, son immunogénicité et la structure des UTRs. Nos résultats montrent que la queue hétérologue A/G est aussi efficace que la queue utilisée dans le vaccin Pfizer-BioNTech et confirment la grande efficacité du 5' UTR de l'a-globine humaine. De plus, le potentiel des 3' UTRs VP6 et SOD a été révélé. Nous avons validé ces résultats en utilisant un ARNm codant la protéine Spike du SARS-CoV-2, formulé en LNP pour l'immunisation murine. Globalement, les 3' UTRs sélectionnées et la queue hétérologue A/G offrent un fort potentiel comme nouveaux éléments pour la conception de l'ARNm thérapeutique. En résumé, nos travaux soulignent l'importance du choix du lipide auxiliaire dans la formulation des LNP, et démontrent le rôle déterminant des éléments de séquence d'ARNm, notamment les régions 5' UTR, 3' UTR et la queue poly(A), dans l'amélioration de l'efficacité des traitements à base d'ARNm. Messenger RNA (mRNA) has emerged as an attractive platform for novel drug development. The efficacy of mRNA technology depends on both the efficient delivery and effective translation of mRNA molecules. Despite the remarkable success of mRNA vaccines against SARS-CoV-2, there is still much work to be done to improve delivery systems and mRNA sequence design in order to achieve high efficacy for mRNA vaccines and therapeutics. The first part of this thesis focused on lipid nanoparticles (LNPs) as delivery vehicles for synthetic mRNA. Three LNPs compositions, all containing the ionizable lipids D-Lin-MC3 but differing in their helper lipid composition (DSPC/cholesterol, DOPE/cholesterol and DOPE/b-Sitosterol) were compared in cellulo and in vivo to identify the most effective auxiliary lipids for mRNA delivery. Our results showed that the choice of helper lipid does influence in vivo transfection efficiency, with formulations containing DOPE exhibiting superior performance. The second part of this thesis focused on the optimization of mRNA sequence elements. Intending to improve the translation of synthetic mRNA, we evaluated various untranslated regions (UTRs) and tail designs, using Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine sequence architecture as a reference. First, we screened six 5' UTRs (cap-dependent/independent), evaluated nine 5' UTR-3' UTR combinations, and a novel heterologous A/G tail in cell models, and in vivo using luciferase as a reporter gene. Then, to decipher the translation mechanism of selected UTRs, we correlated mRNA expression with ribosome load, mRNA half-life, mRNA immunogenicity, and UTR structures. Our results showed that the heterologous A/G tail introduced is as potent as the Pfizer-BioNTech tail and confirmed the high potency of the human a-globin 5' UTR. They also revealed the potential of the VP6 and SOD 3' UTRs. We validated our results using mRNA encoding the SARS-CoV-2 spike protein formulated as lipid nanoparticles (LNPs) for mouse immunization. Overall, the selected 3' UTRs and heterologous A/G tail have great potential as new elements for therapeutic mRNA design. In summary, our findings emphasize the critical role of helper lipid selection in LNP formulations and demonstrate the significance of mRNA sequence elements including the 5' UTR, 3' UTR, and poly(A) tail in advancing the efficacy of mRNA therapeutics. |
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| Popis jednotky: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Marc Boudvillain (Président du jury) ; Clément Chapat, Josef Hamacek (Membre(s) du jury) ; Maria Duca, Emmanuelle Schmitt (Rapporteur(s)) |
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