Enzymatic kinetics of extracellular matrix remodeling : analytical and biophysical characterizations of synthetic models
Couramment, dans la recherche biochimique on mesure la cinétique et l'activité enzymatiques in vitro dans des milieux aqueux dilués. Cependant, ces conditions ne reflètent pas la réalité de l'organisme humain, en particulier du cytosol ou de la matrice extracellulaire (MEC). La MEC constit...
Kaydedildi:
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| Diğer Yazarlar: | , , , , , |
| Materyal Türü: | Thèse numérique |
| Dil: | Anglais Français |
| Baskı/Yayın Bilgisi: |
2025.
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Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV Partenaire(s) de recherche : CBM - Centre de Biophysique Moléculaire (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Reine Nehmé (Président du jury) ; Alexandre Chenal, Fabio Sterpone, Charlotte Vendrely (Membre(s) du jury) ; Alexandre Chenal, Fabio Sterpone (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Cinétique enzymatique de remodelage de la matrice extracellulaire :, caractérisations analytique et biophysique de modèles synthétiques |
| Özet: | Couramment, dans la recherche biochimique on mesure la cinétique et l'activité enzymatiques in vitro dans des milieux aqueux dilués. Cependant, ces conditions ne reflètent pas la réalité de l'organisme humain, en particulier du cytosol ou de la matrice extracellulaire (MEC). La MEC constitue un environnement riche en macromolécules telles que protéines fibreuses, protéoglycanes, récepteurs cellulaires et molécules de signalisation. Elle joue un rôle central dans la communication cellulaire lors de processus comme la différenciation, la migration ou la croissance. Une dérégulation de ces mécanismes peut conduire à la formation de tumeurs ou à d'autres pathologies. Le projet X-CROWD, financé par l'ANR, réunit plusieurs laboratoires autour d'un objectif commun : mieux comprendre la cinétique des enzymes de la MEC en conditions encombrées. Il vise également à caractériser l'environnement encombré lui-même, ses interactions avec les composants du milieu et leur diffusion. À la suite de travaux sur l'enzyme hyaluronidase en présence de PEG comme agent encombrant artificiel, l'idée est née d'étudier d'autres enzymes de la MEC avec divers agents. Cette étude s'est centrée sur deux enzymes : une sérine-protéase, l'élastase neutrophile humaine (HNE), et une métalloprotéase matricielle, la métalloprotéase 1 (MMP-1). L'effet de l'encombrement a été introduit à l'aide du polymère dextrane afin d'évaluer si la taille et la concentration de l'agent influencent la cinétique enzymatique. Pour répondre à cette question, la spectrophotométrie de fluorescence a été utilisée afin de suivre la dégradation des substrats par la récupération de fluorescence après clivage. Travailler à forte concentration en substrat et en agent encombrant a entraîné une diminution de l'intensité de fluorescence du produit, nécessitant le développement d'une approche théorique pour corriger ce biais et quantifier correctement le produit libéré. Par ailleurs, la viscosité et la densité du milieu, la diffusion du dextrane et celle de l'eau ont été caractérisées. Les résultats montrent qu'une augmentation de la concentration en dextrane accroît viscosité et densité, tout en réduisant l'autodiffusion et la diffusion de l'eau. De plus, la diffusion des substrats en milieu encombré a été suivie par RMN et a révélé une diminution exponentielle des coefficients de diffusion, indépendante de la taille de l'agent. Comme l'encombrement exerce un effet non universel sur les protéines, en particulier les enzymes et leur cinétique, il reste difficile de prédire son impact par rapport aux mesures classiques en conditions diluées. Cette étude apporte un éclairage sur la cinétique des deux enzymes en présence du dextrane comme agent artificiel, dans le but de comprendre d'abord un système moins complexe, puis de progresser vers l'étude d'environnements plus réalistes incluant des molécules naturelles de la MEC, telles que l'élastine, le collagène ou l'acide hyaluronique, utilisées comme agents encombrants et avec des substrats physiologiques. A common practice in biochemical research is to measure enzyme kinetics and activity in vitro in diluted aqueous media. However, these conditions can't resemble the actual situation in the human organism, or more precisely, in the cytosol or extracellular matrix (ECM). The ECM is an environment rich in different macromolecules such as fibrous proteins, proteoglycans, cell receptors, different signalling molecules, etc. Moreover, it is important for the communication between cells in processes like differentiation, cell migration and growth. Additionally, a dysregulation of any of these processes can lead to tumour formation or other pathologies. The X-CROWD project, funded by the ANR, gathers the scientists from different laboratories working towards the main goal, better understanding the kinetics of the enzymes of the ECM in the crowded environment. Moreover, we aim to characterise the crowded environment itself as well as its interactions with media components, their diffusion, etc. Following the previously published work on the enzyme hyaluronidase in the presence of PEG as an artificial crowder, the idea of studying other enzymes of the ECM in the presence of different crowders emerged. This study was centered on two enzymes: a serine protease Human Neutrophil Elastase (HNE), and a matrix metalloprotease Matrix Metalloprotease 1 (MMP-1). To introduce the crowding effect, a polymer dextran was used to address whether the size and concentration of the crowder have an influence on enzyme kinetics. To elucidate this question, the fluorescence spectrophotometry was used to follow the enzymatic degradation of the substrates through the fluorescence recovery after cleavage. Working in the high substrate concentration regime and introducing the high crowder concentration resulted in a diminution of the fluorescence intensity of the product, which led to a need for the development of a theoretical approach to account for this and successfully quantify the released product. Furthermore, to characterise the media (or the crowder) viscosity, density, self-diffusion of dextran and water diffusion revealed that with an increase in the dextran concentration, the viscosity and density are increasing while both self-diffusion and water diffusion are decreasing. Additionally, the diffusion of substrates was followed in the crowded conditions using NMR, and it revealed the exponential decrease in the diffusion coefficients, but independent of the crowder size. As the crowding has a non-universal effect on the proteins, especially enzymes and their kinetics, it is difficult to predict how will it alter the usual kinetics performed in diluted conditions. This study provides an insight into the kinetics of the two enzymes in presence of the artifcial crowder dextran aiming at the understanding of a less complex system and building towards understanding of a more complex system involving molecules such as elastin, collagen or hyaluronic acid to be used as the natural crowders, closer to the ECM conditions and to use natural substrates in the kinetics studies. |
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| Diğer Bilgileri: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV Partenaire(s) de recherche : CBM - Centre de Biophysique Moléculaire (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Reine Nehmé (Président du jury) ; Alexandre Chenal, Fabio Sterpone, Charlotte Vendrely (Membre(s) du jury) ; Alexandre Chenal, Fabio Sterpone (Rapporteur(s)) |
| Materyal Türü: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Erişim: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 07 novembre 2026 |