Deciphering the mechanisms of action of promising defensins to design a new generation of antimicrobials
Avec l'augmentation spectaculaire de la résistance aux composés antimicrobiens et le nombre limité de nouveaux composés développés, il est urgent de mettre au point des alternatives thérapeutiques. Les peptides antimicrobiens (PAMs) sont des alternatives naturelles prometteuses, avec une grande...
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| Autore principale: | |
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| Altri autori: | , , , , , |
| Natura: | Thèse numérique |
| Lingua: | Anglais |
| Pubblicazione: |
2025.
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| Soggetti: | |
| Accesso online: | Accès au texte intégral https://theses.univ-orleans.fr/public/2025ORLE1002_va.pdf http://www.theses.fr/2025ORLE1002/abes |
| Nota: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Hélène Bénédetti (Président du jury) ; Delphine Destoumieux-Garzón, Philippe Bulet (Membre(s) du jury) ; Markus Weingarth, Isabel Alves (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Déchiffrer les mécanismes d'action de défensines prometteuses pour concevoir une nouvelle génération d'antimicrobiens |
| Riassunto: | Avec l'augmentation spectaculaire de la résistance aux composés antimicrobiens et le nombre limité de nouveaux composés développés, il est urgent de mettre au point des alternatives thérapeutiques. Les peptides antimicrobiens (PAMs) sont des alternatives naturelles prometteuses, avec une grande diversité de mécanismes d'action (MOAs) optimisés depuis des millions d'années. Comprendre leurs MOAs à l'échelle moléculaire/atomique est essentiel pour concevoir des molécules efficaces dérivées des PAMs. L'objectif de ma thèse était de déchiffrer les MOAs de deux PAMs cationiques riches en ponts disulfure prometteurs : ETD151, un peptide antifongique de 44 résidus dérivé des défensines d'insectes (Partie I) et AvBD103b, un peptide antimicrobien de 38 résidus du manchot royal pour son activité antibactérienne (Partie II). La défensine ETD151 est très active contre les champignons pathogènes pour l'Homme et les plantes, et ne présente pas de toxicité. Son mécanisme multifacette nécessite la présence de glucosylcéramides (GlcCers), lipides de la membrane fongique déterminants pour la croissance cellulaire et la virulence du champignon, et donc considérés comme des cibles prometteuses. Cibler les GlcCers fongiques est peu susceptible d'induire rapidement une résistance. En utilisant des approches multidisciplinaires, nous avons prouvé l'interaction moléculaire directe entre ETD151 et le GlcCer fongique, et l'avons étudié à l'échelle atomique. La première étape a consisté à caractériser, par spectrométrie de masse, les deux principales formes de GlcCer du champignon Botrytis cinerea, révélant des structures de base sphingoïde méthylée d19:2/h16:0 et d19:2/h16:1. Nous avons ensuite révélé qu'ETD151 reconnaissait spécifiquement ces GlcCer de B. cinerea insérés dans des liposomes, avec un Kd estimé de l'ordre du micromolaire ( M) par thermophorèse à micro-échelle (MST). Par RMN, nous avons montré que les deux boucles hydrophobes adjacentes d'ETD151 jouaient un rôle majeur dans l'interaction, et aussi dans l'insertion spécifique et la fluidification des liposomes contenant du GlcCer fongique. Enfin, nous avons démontré que le méthyle C9 spécifique aux champignons (absent des GlcCer de mammifères et de plantes) jouait un rôle majeur dans l'interaction. Les éléments biochimiques et structuraux clés que nous avons révélés pour le mécanisme moléculaire par lequel ETD151 cible les GlcCer fongiques in vitro fournissent une base solide pour la conception d'antifongiques mimant les défensines et ciblant spécifiquement les GlcCers fongiques méthylés. La défensine aviaire AvBD103b appartient à une sous-famille différente de défensines. Elle est active contre un large spectre de bactéries Gram+ et Gram-, y compris en milieu salé, et ne présente pas de toxicité. L'hypothèse actuelle est que le MOA d'AvBD103b est non spécifique et multifacette, ce qui défavoriserait le développement de résistance. L'objectif ici est de marquer le peptide et de suivre précisément sa distribution spatiale au cours de son attaque. Pour ce faire, nous avons d'abord transposé une technique innovante d'imagerie par fluorescence sur cellule unique, permettant de disséquer le mécanisme antibactérien des PAMs en temps réel, sur des Escherichia coli vivantes et dans des conditions physiologiques. Nos résultats préliminaires ont montré qu'AvBD103b se localisait préférentiellement dans l'anneau Z où se trouvent les protéines de division cellulaire, et dans la région septale où la synthèse du peptidoglycane est active. Pendant son attaque, AvBD103b resterait principalement à la surface de la cellule. Cependant, une partie du peptide pourrait accéder au cytoplasme et atteindre ainsi de potentiels partenaires moléculaires intracellulaires. Ces nouveaux éléments du mécanisme sont essentiels pour concevoir une nouvelle génération de molécules antibactériennes, en particulier contre les pathogènes qui prospèrent dans des environnements riches en sel (patients atteints de mucoviscidose). With the dramatically increasing of antimicrobial resistance, coupled with the limited number of newly developed antimicrobials, therapeutic alternatives are urgently required. Antimicrobial peptides (AMPs) are promising natural alternatives with a wide diversity of mechanisms of action (MOAs) optimized over millions of years in nature. Understanding their MOAs at the molecular/atomic scale is essential for designing effective therapeutic molecules from AMPs. The aim of my thesis was to decipher the MOAs of two promising disulfide-rich cationic AMPs, namely ETD151, a 44-residue antifungal peptide optimized from insect defensins (Part I), and AvBD103b a 38-residue antimicrobial peptide from the king penguin for its antibacterial activity (Part II). The ETD151 defensin is highly active against human and plant pathogenic fungi without toxicity. Its multifaceted MOA requires the presence of glucosylceramides (GlcCers), fungal membrane lipids that are determinants of cell growth and virulence in fungi, and are therefore considered promising targets. Targeting fungal GlcCer is unlikely to quickly induce resistance. Using multidisciplinary approaches, we proved and studied at the atomic scale the direct molecular interaction between ETD151 and the fungal GlcCer. The first step was to characterize by mass spectrometry the two main forms of GlcCers from Botrytis cinerea fungus, revealing a methylated-sphingoid base structures, d19:2/h16:0 and d19:2/h16:1, respectively. Then, we revealed that ETD151 selectively recognizes these B. cinerea GlcCers containing in liposomes with a Kd estimated at ~ M by microscale thermophoresis. By NMR, we identified that the two adjacent hydrophobic loops of ETD151 monopolize probably the binding, the specifically insertion into and fluidization of liposomes containing fungal GlcCer. Finally, we showed that the C9-methyl in the sphingoid base, a feature specific to fungi compared to mammals and plants, plays a major role in the ETD151-GlcCer interaction. The key biochemical and structural elements we have revealed for the molecular mechanism by which ETD151 targets fungal GlcCers in vitro, provide a solid structural basis for the design of defensin-mimetic antifungals specifically targeting methylated fungal GlcCer. The avian defensin AvBD103b belongs to a different subfamily of defensins. It is active against a wide panel of Gram+ and Gram- bacteria, with the advantage of being salt-insensitive, and without toxicity. The MOA of AvBD103b is supposed to be non-specific and multifaceted, preventing bacteria from developing a resistance mechanism. The aim here is to label the peptide, and monitor precisely its spatial distribution during its bacterial attack. To achieve this, we first implemented an innovative single-cell fluorescence imaging technique that allows to dissect the antibacterial mechanism of AMPs in real time, on living Escherichia coli, and in physiological conditions. Our preliminary results showed that AvBD103b localizes preferentially in the Z-ring, where cell division proteins are located, and in the septal region, where peptidoglycan synthesis is active. Throughout its attack, AvBD103b remains mainly on the cell surface. However, part of the peptide may eventually reach the cytoplasm and thus multiple potential intracellular molecular partners. The new MOA elements provided here are essential to design a new generation of antibacterial molecules, particularly against pathogens that thrive in salt-rich environments (cystic fibrosis patients). |
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| Descrizione del documento: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Hélène Bénédetti (Président du jury) ; Delphine Destoumieux-Garzón, Philippe Bulet (Membre(s) du jury) ; Markus Weingarth, Isabel Alves (Rapporteur(s)) |
| Natura: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Accesso: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 12 septembre 2025 |