Synthèse de protéines par ligation chimique : étude méthodologique pour s'affranchir de la formation d'aspartimide & application aux peptides et protéines SUMOylés
La synthèse chimique de protéines, dont le succès est en grande partie dû au développement de la ligation chimique native (NCL), représente une alternative intéressante pour obtenir des cibles protéiques inaccessibles par voie recombinante, notamment pour les protéines munies de modifications post-t...
Enregistré dans:
| Auteur principal: | |
|---|---|
| Autres auteurs: | , , , , , |
| Format: | Thèse numérique |
| Langue: | Français Anglais |
| Publié: |
2024.
|
| Sujets: | |
| Accès en ligne: | Accès au texte intégral https://theses.fr/2024ORLE1063/abes https://theses.hal.science/tel-05618533 |
| Note: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Grégory Chaume (Président du jury) ; Fabienne Burlina, Didier Boturyn, Marie-Aude Hiebel, Hélène Bénédetti (Membre(s) du jury) ; Fabienne Burlina, Didier Boturyn (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Protein synthesis by chemical ligation :, methodological study to overcome aspartimide formation and application to SUMOylated peptides and proteins |
| Résumé: | La synthèse chimique de protéines, dont le succès est en grande partie dû au développement de la ligation chimique native (NCL), représente une alternative intéressante pour obtenir des cibles protéiques inaccessibles par voie recombinante, notamment pour les protéines munies de modifications post-traductionnelles (PTMs) spécifiques. La protéine SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) est impliquée dans une PTM consistant en la formation d'une liaison isopeptidique entre l'extrémité C-terminale de SUMO et la chaine latérale d'une lysine de la protéine cible. Bien que cette PTM ait été mise en évidence dans divers processus cellulaires vitaux et que sa dérégulation est associée à des pathologies, son étude est relativement complexe en raison des défis liés à l'obtention de conjugués SUMOylés. L'objectif de ma thèse était de développer une méthodologie permettant d'obtenir des outils de chémobiologie conçus pour déchiffrer le rôle de la SUMOylation. Cette méthodologie repose sur la conjugaison d'une protéine synthétique SUMO-2 (93 acides aminés) équipée en C-ter d'un alcyne avec une protéine fonctionnalisé par un groupement azoture, via une réaction de cycloaddition azoture-alcyne catalysée par le cuivre(I) (CuAAC). Le triazole formé est un excellent mime de la liaison isopeptidique et résiste à l'hydrolyse par les protéases. Lors d'une première tentative de synthèse de SUMO-2, nous avons suspecté la formation d'aspartimide durant la NCL. L'aspartimide est un cycle à 5 chainons pouvant avoir des impacts néfastes sur les propriétés des protéines. Il résulte de l'attaque nucléophile de l'azote d'une liaison peptidique sur la chaîne latérale d'un résidu Asp ou Asn adjacent. Son hydrolyse et/ou son épimérisation peuvent conduire à la formation de L/D-Asp et L/D-isoAsp. Malgré que cette réaction soit bien connue in vivo et en synthèse de peptides sur support solide (SPPS), elle a été rarement mentionnée dans le contexte de la NCL. Après avoir démontré que la formation d'aspartimide pendant la NCL est probablement courante, et représente donc un problème sous-estimé, nous avons décidé de développer une stratégie simple, efficace, et généralement applicable pour s'en affranchir. Celle-ci a été validée par la synthèse de SUMO-2 et d'un analogue équipé d'un alcyne C-terminal. À partir de ce dernier, un mime de peptide SUMOylé a été obtenu par le biais d'une réaction de CuAAC, et nous avons démontré la résistance à une SUMO protéase du lien triazole formé. Dans un second temps, la méthodologie a été étendue à la synthèse d'une protéine SUMOylée en explorant deux approches, l'une purement chimique, et l'autre associant la production par voie recombinante de protéines intégrant un acide aminé non-canonique équipé d'un azoture. Chemical protein synthesis, with success being particularly centered around native chemical ligation (NCL), represents an appealing alternative for obtaining protein targets that are inaccessible through recombinant methods, especially those with specific post-translational modifications (PTMs). The SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) protein is involved in a PTM consisting of the formation of an isopeptide bond between the C-terminal end of SUMO and the side chain of a lysine of the target protein. Although this PTM is implicated in various vital cellular processes, and its dysregulation is associated to pathologies, its study is relatively complex due to challenges involved in obtaining SUMOylated conjugates. The aim of my thesis was to develop a methodology for generating chemical biology tools designed to decipher the role of SUMOylation. This methodology relies on conjugating a synthetic SUMO-2 protein (93 amino acids) equipped with a C-terminal alkyne to a protein containing an azide function, through a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition reaction (CuAAC). The formed triazole is an excellent mimic of the isopeptide bond and resists hydrolysis by proteases. During an initial attempt to synthesize SUMO-2, aspartimide formation during NCL was suspected. Aspartimide is a five-membered ring that can have detrimental effects on the properties of proteins. It results from the nucleophilic attack of the nitrogen atom of a peptide bond to the side chain of an adjacent Asp or Asn residue. Despite being well-known in vivo and in solid-phase peptide synthesis (SPPS), its occurrence during NCL has scarcely been reported. After demonstrating that aspartimide formation during NCL is likely common and thus represents an underestimated problem, we decided to develop a simple, efficient, and generally applicable strategy to overcome it. This was validated through the synthesis of the SUMO-2 protein and an analogue equipped with a C-terminal alkyne. Using the latter, the synthesis of a SUMOylated peptide was achieved through a CuAAC reaction, and we demonstrated the generated triazole linkage was completely resistant to a SUMO protease. Subsequently, the methodology was extended to the synthesis of a SUMOylated protein, exploring two approaches: one purely chemical and the other combining the recombinant production of proteins integrating a non-canonical amino acid containing an azide group. |
|---|---|
| Description: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Grégory Chaume (Président du jury) ; Fabienne Burlina, Didier Boturyn, Marie-Aude Hiebel, Hélène Bénédetti (Membre(s) du jury) ; Fabienne Burlina, Didier Boturyn (Rapporteur(s)) |
| Format: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Accès: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 06 mai 2026 |