Combiner la MST à la CE : une stratégie d'intérêt pour l'évaluation des interactions enzyme/ligand de petite taille dans des lysats cellulaires
Ce projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l'électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de...
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| Autor Principal: | |
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| Outros autores: | , , , , , |
| Formato: | Thèse numérique |
| Idioma: | Français Anglais |
| Publicado: |
2024.
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| Sujets: | |
| Acceso en liña: | Accès au texte intégral https://theses.univ-orleans.fr/public/2024ORLE1057_va.pdf http://www.theses.fr/2024ORLE1057/abes https://theses.hal.science/tel-05183903 |
| Nota: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Josef Hamacek (Président du jury) ; Claire Smadja, Yoann Ladner, Muriel Sebban (Membre(s) du jury) ; Claire Smadja, Yoann Ladner (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Combining MST and CE :, a strategy of interest for assessing enzyme/small ligand interactions in cell lysates |
| Résumé: | Ce projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l'électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de radioactivité. Comme preuve de concept, nous avons étudié l'inhibition des LIM kinases (LIMK1 et LIMK2), des cibles thérapeutiques prometteuses pour la neurofibromatose de type 1, certains cancers et maladies neurologiques. Des centaines de molécules inhibitrices des LIMKs avec des constantes de dissociation (Kd) de l'ordre du nanomolaires in vitro ont été rapportées, mais seule la molécule LX7101 a atteint la phase clinique I/IIa, sans résultats publiés. La MST utilisée nécessite que l'un des partenaires de l'interaction soit fluorescent. Pour travailler dans des lysats cellulaires, la fluorescence rouge est optimale en termes de sélectivité et de sensibilité. Nous avons produit les protéines LIMK1, LIMK2, ainsi que leurs domaines catalytiques Kin1 et Kin2, fluorescentes dans les cellules HEK293 en les fusionnant avec la miRFP670 ( / = 650/670 nm). Avant les essais MST, la production des protéines étiquetées a été confirmée par Western blot et leurs activités catalytiques par CE. Ce travail montre pour la première fois que la miRFP670 peut être utilisée comme protéine de fusion fluorescente pour des essais en MST, éliminant ainsi les étapes de purification de la cible à partir du lysat cellulaire. La méthodologie MST a été développée et validée en évaluant l'affinité de liaison des inhibiteurs LX7101, BMS-5, T56-LIMKi et TH-257. Nous avons également utilisé la MST pour évaluer les paramètres thermodynamiques ( H, S et G) des interactions entre les LIMKs et leurs inhibiteurs dans des lysats cellulaires. Les résultats montrent que l'entropie ( S) s'oppose à l'interaction, tandis que l'enthalpie ( H) la favorise. Pour développer des inhibiteurs de LIMKs capables de passer les essais cliniques, il serait alors bénéfique d'améliorer le terme entropique en développant des actifs plus hydrophobes. Les avantages de la MST pour mesurer les paramètres thermodynamiques et d'affinité de la liaison cible/ligand dans des conditions proches du in vivo en font un outil précieux en chimie médicinale et en santé. De plus, le couplage des essais d'activité catalytique et d'affinité via l'utilisation combinée de la CE et de la MST constitue une approche intéressante pour cribler des candidats médicamenteux, comprendre leurs mécanismes de liaison et leurs effets modulateurs dans un milieu cellulaire. L'approche développée est économe en réactifs, fiable, simple, robuste, rapide et parfaitement adaptée aux milieux biologiques complexes. This thesis project aimed to develop an analytical strategy using MicroScale Thermophoresis (MST) and Capillary Electrophoresis (CE) to quantitatively assess enzyme/small molecule interactions directly in cell lysates, without purification or the use of radioactivity. As a proof of concept, we studied the inhibition of LIM kinases (LIMK1 and LIMK2), promising therapeutic targets for neurofibromatosis type 1, certain cancers, and neurological diseases. Hundreds of LIMK inhibitor with dissociation constants (Kd) in the nanomolar range in vitro have been reported, but only the molecule LX7101 has reached clinical phase I/IIa, with no published results. The MST technique we used requires one of the interaction partners to be fluorescent. To work in cell lysates, red fluorescence is optimal in terms of selectivity and sensitivity. We produced LIMK1, LIMK2 proteins, as well as their catalytic domains Kin1 and Kin2, fluorescent in HEK293 cells by fusing them with miRFP670 ( / = 650/670 nm). Before the MST assays, the production of labeled proteins was confirmed by Western blot and their catalytic activities by CE. This work demonstrates for the first time that miRFP670 can be used as a fluorescent fusion protein for MST assays, thereby eliminating the purification steps of the target from cell lysates. The MST methodology was optimized and validated by evaluating the binding affinity of the inhibitors LX7101, BMS-5, T56-LIMKi, and TH-257. We also used MST to evaluate the thermodynamic parameters ( H, S, and G) of the interactions between LIMKs and their inhibitors in cell lysates. The results show that entropy ( S) opposes the interaction, while enthalpy ( H) favors it. To develop LIMK inhibitors able to pass clinical trials, it would be beneficial to improve the entropic term by developing more hydrophobic compounds. The advantage of MST in measuring thermodynamic and binding parameters of target/ligand binding under near in vivo conditions makes it a valuable tool in medicinal chemistry and health science. Additionally, coupling catalytic activity and binding affinity assays through the combined use of CE and MST constitutes an interesting approach for screening drug candidates, understanding their binding mechanisms, and their modulatory effects in a cellular environment. The developed approach is reagent-efficient, reliable, simple, robust, fast, and perfectly suited for complex biological environments. |
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| descrición da copia: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Josef Hamacek (Président du jury) ; Claire Smadja, Yoann Ladner, Muriel Sebban (Membre(s) du jury) ; Claire Smadja, Yoann Ladner (Rapporteur(s)) |
| Formato: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Acceso: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 23 juillet 2025 |