Conception rationnelle de S-Glycosyltransférases issues d'Arabidopsis thaliana à façon : de la modélisation aux applications thérapeutiques et cosmétiques
L'ingénierie enzymatique dans la synthèse des glycosides a été utilisée avec compétence pour améliorer la vitesse, la sélectivité, voire conduire le mécanisme enzymatique vers de nouvelles réactions (transglycosidase, thioglycoligase, ). Cependant, lorsque la structure du produit glycosidique r...
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| Format: | Thèse numérique |
| Langue: | Français Anglais |
| Publié: |
2022.
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| Sujets: | |
| Note: |
Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Christelle Breton (Président du jury) ; Christelle Breton, Corinne André Miral, Céline Landon, Gerd Wagner (Membre(s) du jury) ; Christelle Breton, Corinne André Miral (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Rational design of tailor made S-Glycosyltransferases from Arabidopsis thaliana :, from modeling to therapeutic and cosmetic applications |
| Résumé: | L'ingénierie enzymatique dans la synthèse des glycosides a été utilisée avec compétence pour améliorer la vitesse, la sélectivité, voire conduire le mécanisme enzymatique vers de nouvelles réactions (transglycosidase, thioglycoligase, ). Cependant, lorsque la structure du produit glycosidique recherché doit être modifiée (structures du sucre et/ou de l'aglycone, nature de la liaison glycosidique), cela nécessite souvent l'identification d'une nouvelle enzyme, qui doit ensuite être modifiée pour fournir le biocatalyseur désiré. Dans le cadre de ce projet, nous visons à fournir une approche modulaire pour générer des biocatalyseurs sur mesure, basés sur la structure du glycoside ciblé. Pour répondre à ce challenge, nous avons basé cette méthodologie sur la structure particulière des glycosyltransférases de la famille GT-B, qui sont composées de deux domaines séparés se faisant face ; chacun d'eux se liant sélectivement au nucléotide-sucre donneur (C-ter) ou accepteur (N-ter). En nous appuyant sur des travaux fondateurs qui ont prouvé la faisabilité d'échanger des domaines et de générer des chimères actives, nous avons cherché à proposer une approche modulaire complète (Mix-and-Match), basée sur la co-expression de domaines séparés souhaités dans l'hôte d'expression. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la production de domaines de GT-B à partir de 4 enzymes (UGT74B1, UGT74C1, UGT51, UGT78G1) issues de 3 organismes différents. En réalisant la co-expression des différents domaines, 8 enzymes sous forme de dimères ont été créées. La mise au point et l optimisation des différentes étapes de clonage, production, et purification ont permis l obtention de 6 des 8 enzymes dimériques créées. Parmi elles, la N( )//C( ) composée des domaines accepteurs N-terminal UGT74B1 et du domaine C-terminal UGT74C1 est la seule à avoir présenté une activité catalytique. Cette enzyme a été caractérisée, criblée en activité de glycosylation, modélisée et comparée avec l enzyme UGT74B1. À la suite du criblage et de la modélisation, N( )//C( ) présentait une sélectivité de substrat plus large qui pourrait être attribuée à une interface plus flexible entre les deux domaines. De même, la non-activité d une des enzymes dimériques N( )//C( ) est due à une reconformation des domaines montrés par dénaturation thermique. Finalement, l étude de l influence du lien inter-domaines a été étudiée en réalisant l enzyme N( )-C( ) et en comparant les différentes caractéristiques enzymatiques et de synthèse de S- et O-glycoside. Ces premiers essais préliminaires s avèrent très prometteurs pour la validation du concept de formation de GT modulaires par co-expression de domaine afin de générer des biocatalyseurs sur mesure et ouvrent la voie à une nouvelle approche d'ingénierie biocatalyseur pour la synthèse des glycosides. Enzyme engineering in glycosides synthesis has been proficiently used to improve rate, selectivity, and even drive the enzymatic mechanism towards new reactions (transglycosidase, thioglycoligase, ). However, when the structure of the desired glycosidic product has to be modified (structures of the sugar and/or the aglyclone, nature of the glycosidic bond), it often requires the identification of a new enzyme, which then need to be subsequently engineered to afford the desired biocatalyst. In this project we aimed at providing a modular approach to generate tailored biocatalysts, based on the structure of the targeted glycoside. In order to take up this challenge, we based this methodology on the peculiar structure of Glycosyltransferases from GT-B family, that are composed of two separated domains facing each other; each of them binding selectively either the nucleotide-sugar donor (C-ter) or acceptor (N-ter). Relying on seminal works that proved the feasibility to swap domains and generate active chimeras, we aimed at offering a complete modular approach (Mix-and-Match), based on the co-expression of desired separated domains in expression host. In this context, we were interested in the production of GT-B domains from 4 enzymes (UGT74B1, UGT74C1, UGT51, UGT78G1) from 3 different organisms. By realizing the co-expression of the different domains, 8 enzymes in the form of dimers were created. The development and optimization of the different cloning production and purifications steps made it possible to obtain 6 of 8 dimeric enzymes created. Among them, N( )//C( ) composed of the N-terminal UGT74B1 acceptor domains and the C-terminal domain UGT74C1 is the only one to have shown catalytic activity. This enzyme has been characterized, screened for glycosylation activity, modeled and compared with the enzyme UGT74B1. As a result of screening and modeling N( )//C( ) exhibited broader substrate selectivity which could be attributed to a more flexible interface between the two domains. Similarly, the non-activity of one of the N( )//C( ) dimeric enzymes is due to a reconformation of the domains shown by thermal denaturation. Finally, the study of the influence of the inter-domain link was studied by realizing the enzyme N( )-C( ) and by comparing the different enzymatic characteristics and synthesis of S- and O-glycoside. These first preliminary tests show great promise for the proof of concept of modular GT formation by domain co-expression to generate tailor-made biocatalysts and paves the way for a new biocatalyst engineering approach for glycoside synthesis. |
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| Description: | Titre provenant de l'écran-titre Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Christelle Breton (Président du jury) ; Christelle Breton, Corinne André Miral, Céline Landon, Gerd Wagner (Membre(s) du jury) ; Christelle Breton, Corinne André Miral (Rapporteur(s)) |
| Format: | Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF |
| Accès: | Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 14 mars 2028 |