Development of chemo-enzymatic methodologies for the total synthesis of proteins through solid-supported chemical ligation
La synthèse totale de protéines requiert l'assemblage de segments peptidiques déprotégés par des réactions de ligation, telle la native chemical ligation (NCL). Lorsque de nombreuses ligations successives sont mises en œuvre, la nécessité de purifier les intermédiaires réactionnels conduit souv...
Gorde:
| Egile nagusia: | |
|---|---|
| Beste egile batzuk: | , , , , |
| Formatua: | Thèse numérique |
| Hizkuntza: | Anglais Français |
| Argitaratua: |
2020.
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| Gaiak: | |
| Sarrera elektronikoa: | Accès au texte intégral https://theses.univ-orleans.fr/public/2020ORLE3173_va.pdf http://www.theses.fr/2020ORLE3173/abes https://theses.hal.science/tel-03866547 |
| Oharra: |
Titre provenant de l'écran-titre Thèse soutenue sur un ensemble de travaux Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) Autre(s) contribution(s) : Chrystel Lopin-Bon (Président du jury) ; Chrystel Lopin-Bon, Vladimir Torbeev, Muriel Amblard, Sébastien Papot (Membre(s) du jury) ; Vladimir Torbeev, Muriel Amblard (Rapporteur(s)) |
| Autres localisations: | Voir dans le Sudoc |
| Variante du titre: | Développement de méthodologies chimio-enzymatiques pour la synthèse de protéines par ligation chimique sur support solide |
| LEADER | 08728nam a22005297a 4500 | ||
|---|---|---|---|
| 001 | 995871 | ||
| 008 | 221122s2020 xxe ||| |||| 00| 0 eng d | ||
| 009 | PPN265813913 | ||
| 041 | 0 | |a eng |a fre |b fre |b eng | |
| 082 | |a 547.21 | ||
| 082 | |a 572.6 | ||
| 084 | |a 540 | ||
| 084 | |a 570 | ||
| 100 | 1 | |a Abboud, Skander, |d 1989- | |
| 240 | 1 | 0 | |a Développement de méthodologies chimio-enzymatiques pour la synthèse de protéines par ligation chimique sur support solide |
| 245 | 1 | 0 | |a Development of chemo-enzymatic methodologies for the total synthesis of proteins through solid-supported chemical ligation |c Skander Abboud ; sous la direction de Vincent Aucagne. |
| 256 | |a Données textuelles | ||
| 260 | |c 2020. | ||
| 500 | |a Titre provenant de l'écran-titre | ||
| 500 | |a Thèse soutenue sur un ensemble de travaux | ||
| 500 | |a Ecole(s) Doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....) | ||
| 500 | |a Partenaire(s) de recherche : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....) (Laboratoire) | ||
| 500 | |a Autre(s) contribution(s) : Chrystel Lopin-Bon (Président du jury) ; Chrystel Lopin-Bon, Vladimir Torbeev, Muriel Amblard, Sébastien Papot (Membre(s) du jury) ; Vladimir Torbeev, Muriel Amblard (Rapporteur(s)) | ||
| 502 | |a Thèse de doctorat. Chimie. Orléans. 2020 | ||
| 506 | |a Thèse soumise à l'embargo de l'auteur jusqu'au 16 décembre 2021 | ||
| 520 | |a La synthèse totale de protéines requiert l'assemblage de segments peptidiques déprotégés par des réactions de ligation, telle la native chemical ligation (NCL). Lorsque de nombreuses ligations successives sont mises en œuvre, la nécessité de purifier les intermédiaires réactionnels conduit souvent à de faibles rendements globaux. Une solution pour s affranchir de ces étapes de purification est d assembler les protéines par ligation sur support solide (SPCL). Cette approche a cependant été jusqu'à présent essentiellement limitée à des preuves de concept, l'une des raisons principales étant la difficulté d'immobiliser le premier segment peptidique sur un support adapté via un bras qui peut être coupé une fois les ligations effectuées. De nombreux bras ont été décrits, mais leur coupure nécessite des conditions incompatibles avec certaines protéines cibles. L'objectif principal de cette thèse était de développer une nouvelle génération de bras en explorant une approche enzymatique plutôt que purement chimique, afin d'induire une coupure douce et sélective. Un premier bras coupé par la beta-galactosidase a été étudié, mais les cinétiques de coupures sur support solide se sont avérées très lentes. Nous avons émis l hypothèse que la grande taille de l'enzyme (540 kDa) ralentissait sa diffusion à l'intérieur du support. Par conséquent, un second bras conçu pour être coupé par des enzymes plus petites a été synthétisé. Dans le cas de la lambda-phosphatase (25 kDa), le rapport entre les vitesses de coupure en solution et sur support a été multiplié par un facteur 300, comparé au premier bras. Ces travaux ont aussi traité d autres limites de la synthèse de protéines par ligation telle que la manipulation de segments peu solubles. Nous avons ainsi développé un tag solubilisant qui peut être introduit de façon automatisée sur une cystéine N-terminale, par l intermédiaire d un pont disulfure. Le segment ainsi modifié peut être facilement purifié, et le pont disulfure est ensuite coupé instantanément dans les conditions de NCL. Le développement de techniques plus efficaces de synthèse des segments a également été abordé, dans le cadre d une étude approfondie d un protocole décrit précédemment pour la synthèse de peptides crypto-thioesters N-Hnb-Cys, capables de former des thioesters in situ lors de la NCL. Ce travail a conduit à l'identification d'une variété de co-produits et à l'optimisation d'un protocole de synthèse facile à mettre en œuvre, automatisable et reproductible. L'utilité de toutes ces méthodes a été démontrée par la synthèse d'un polypeptide de 160 acides aminés, par ligation de trois segments sur support solide. | ||
| 520 | |a The total synthesis of proteins requires the assembly of unprotected peptide segments through ligation reactions, such as native chemical ligation (NCL). The need of intermediate purifications is a strong limitation, as this generally leads to low overall yield when numerous successive ligations are implemented. An early-recognized solution to this problem is the assembly of the protein on a solid support. Although extremely appealing, solid phase chemical ligation (SPCL) has been so far essentially limited to proof-of-concepts, one of the main reason being the difficulty to immobilize a first peptide segment on a water-compatible solid support through a dedicated SPCL linker which could be cleaved after assembly completion. A wide range of linkers have been described, but their cleavage require chemical conditions that proved to be incompatible with some sensitive targets. The main aim of this work was the development of a next generation of linkers by exploring an enzymatic rather than a purely chemical approach, in order to induce a cleavage under extremely mild and selective conditions. A first beta-galactosidase cleavable linker was explored however, cleavage kinetics on solid support were slow. We assumed that the large size of the enzyme (540 kDa) hampered its diffusion inside the solid support. Hence, a second linker designed to be cleaved by smaller enzymes was synthesized. In the case of lambda-phosphatase (25 kDa), the relative cleavage rate, solid vs solution phase, was increased by a factor of 300. Besides linkers, this work focused on addressing other bottlenecks associated to NCL-based chemical protein synthesis such as the handling of poorly soluble fragments. Therefore, we developed a method that makes use of a key solid-supported disulfide formation to introduce a 2-amino-2,2-dimethylsulfanyl (Ades) moiety that can be further used as an NCL labile handle to introduce a solubilizing tag on N-terminal cysteinyl peptides through standard Fmoc-SPPS. We also worked on the development of more efficient synthesis methods by the in-depth reinvestigation of a previously described protocol for N-Hnb-Cys peptide crypto-thioesters synthesis, which are capable of forming thioesters in situ under NCL conditions. This optimization work led to the identification of a variety of deleterious by-products and to the optimization of an automatable and highly reproducible synthetic protocol leading to clean peptide crypto-thioester segments. The utility of all these methods was demonstrated by the solid supported synthesis of a 160 residues polypeptide assembled from three fragments. | ||
| 538 | |a Configuration requise : un logiciel capable de lire un fichier au format : PDF | ||
| 650 | |a Synthèse protéique | ||
| 650 | |a Composés organiques | ||
| 650 | |a Peptides | ||
| 650 | |a Thèses et écrits académiques | ||
| 700 | 1 | |a Aucagne, Vincent, |d 1975-...., |c auteur en chimie. |4 ths | |
| 700 | 1 | |a Lopin-Bon, Chrystel, |d 1975-...., |c professeure de chimie organique. |4 opn | |
| 700 | 1 | |a Torbeev, Vladimir. |4 opn | |
| 700 | 1 | |a Amblard, Muriel, |d 1965- |4 opn | |
| 700 | 1 | |a Papot, Sébastien, |d 19..- |4 opn | |
| 710 | 2 | |a Université d'Orléans. |4 dgg | |
| 787 | 0 | 8 | |i Reproduced as: |t Solid-phase Chemical Ligation. Chapter 9 |f Skander A. Abboud, Agnès F. Delmas, Vincent Aucagne |n Wiley |d 2021 |
| 787 | 0 | 8 | |i Reproduced as: |t Enzyme-cleavable linkers for protein chemical synthesis through solid-phase ligations |f Skander A. Abboud, Mehdi Amoura, Brigitte Renoux, Sébastien Papot, Véronique Piller, Vincent Aucagne |n Wiley |d 2021 |
| 787 | 0 | 8 | |i Reproduced as: |t An optimized protocol for the synthesis of N-2-hydroxybenzyl-cysteine peptide crypto-thioesters |f Skander A. Abboud, Vincent Aucagne |n Organic & Biomolecular Chemistry |d 2020 |
| 787 | 0 | 8 | |i Reproduced as: |t A straightforward methodology to overcome solubility challenges for N-terminal cysteinyl peptide segments used in native chemical ligation |f Skander A. Abboud, El hadji Cisse, Michel Doudeau, Hélène Bénédetti, Vincent Aucagne |n Chemical Science |d 2021 |
| 856 | 4 | |q PDF |s 20553546 |u http://www.theses.fr/2020ORLE3173/document |z Accès au texte intégral | |
| 856 | 4 | |u https://theses.univ-orleans.fr/public/2020ORLE3173_va.pdf | |
| 856 | 4 | |u http://www.theses.fr/2020ORLE3173/abes | |
| 856 | 4 | |u https://theses.hal.science/tel-03866547 | |
| 997 | |0 995871 |1 Thèse numérique |a Ressource numérique |b INSA |b ENSA |c 0/Bibliothèque numérique/ |c 1/Bibliothèque numérique/Autre ressource numérique/ | ||